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文献专栏

如何溶解多肽和聚氨基酸-多肽的溶解性-多肽溶解指南

发表时间:2019-09-13 09:14

多肽/聚氨基酸的溶解性很大程度上取决于多肽/氨基酸的极性。酸性的多肽溶解于碱性溶液,而碱性多肽可溶解于酸性溶液。含有大量不带电荷的极性氨基酸残基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有机溶剂中,如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或异丙醇,然后加水(蒸馏水)稀释。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解,因为DMSO可能造成侧链氧化。


      多肽溶解测试: 在多肽溶解之前先取小部分进行多肽溶解测试,您需要测试几种不同的溶剂,直到找到最适当的一种(根据实验需求及溶解性实验确定)。超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。(注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。)

      1. 将每个酸性氨基酸赋值为-1,包括天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、以及C端-COOH。每个碱性氨基酸赋值为+1,包括精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)以及N端-NH2。然后计算整个多肽的电荷数。

      2. 如果整段肽所带电荷是正电荷的,说明该肽是碱性的。可先尝试用蒸馏水来溶解;如果不溶于水,接着尝试用少量10%-25%醋酸溶解,如果仍然失败的话,添加一些TFA(10-50微升)来增溶,然后用水稀释至理想浓度。

      3. 如果整段肽所带电荷是负电荷的,说明该肽是酸性的。可先尝试用蒸馏水来溶解;如果不溶于水,可以尝试用PBS(PH 7.4)来溶解,如果再不溶的话,添加少量的碱性溶剂,如0.1 M的碳酸氢铵,然后加水稀释至理想浓度。含有游离半胱氨酸的多肽应溶于脱气的酸性缓冲液中,因为当PH值大于7时,巯基会被迅速氧化成二硫化物。

      4. 如果整段肽电荷是零,说明肽是中性的。中性肽通常溶于有机溶剂。首先,尝试添加少量乙腈、甲醇或异丙醇。对于高度疏水的多肽,可使用少量的二甲基亚砜溶解,然后用水稀释至理想浓度。对于含有自由半胱氨酸的肽,需使用DMF而不是DMSO。对于有聚集倾向的肽,可添加6M盐酸胍或8M尿素,然后进行必要的稀释。

      为了防止或尽量减少多肽降解,请将多肽以冻干粉形式保存在-20°C,-80°C更佳。如果需要保存溶液肽,最好分成小样存放,以避免反复冻融。一份样品融冻后未用完,应扔掉。细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦,所以请将肽溶于无菌水或肽溶液过滤除菌。


碱性氨基酸: K, R, H, N-terminus

酸性氨基酸: D, E, C-terminus

极性中性氨基酸: S,N,Q,T,C,P

非极性疏水氨基酸: G, A,M,F,W,V, Y,I,L 乙酰基,酰胺基

举例说明:

KKEEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 认为是碱性多肽,见步骤2

ERDDFILGASEHK: (+4) + (-5) = -1 认为是酸性多肽,见步骤3

AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 认为是中性多肽,见步骤4

    通常,酸性、碱性氨基酸数量超过氨基酸总数的50%,可以用水进行溶解。如果在具体的实验过程中有溶解性问题,可点击此处,对溶解性进行预测或联系我们,获得技术支持。


多肽的溶解性

溶解性是使用多肽时比较重要的条件。每个氨基酸都有其固有物理特性。如亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸是疏水性的,其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸、精氨酸是亲水性的。因此不同的多肽因其组成不同而具有不同的溶解性。

杭州专肽生物合成的所有多肽均是以冻干的形式提供给您,请您在使用之前仔细阅读以下说明书,以确保多肽在溶解和保存过程中不影响您的使用:

  1. 如何正确溶解多肽?

  溶解性是使用多肽时比较重要的问题。每个氨基酸都有其固有化学特性。如亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、颉氨酸Val是疏水性的,其他氨基酸如赖氨酸Lys、组氨酸His、精氨酸Arg是亲水性的。因此不同的多肽因其组成不同而具有不同的溶解性。

  备注:在多肽溶解之前,建议您先用少量肽来试验最适溶解方法,只有当多肽完全溶解后,才能加入水或缓冲液将之稀释至最终浓度

  2. 如何溶解易溶性多肽?

  一般情况下,多肽首先选择溶解在灭菌的蒸馏水或去离子水中。

  如果这个肽是不溶于水的,且其是酸性的,加入温和的碱如0.1%的NH4OH能够增加肽的溶解度。相反,对于碱性的肽,温和的酸如0.1%的醋酸或TFA(三氟乙酸)能够帮助多肽溶解。

  3. 如何溶解疏水性多肽?

  在一些情况下,某些肽具有很高的疏水性时,不易溶解,可以用少量的DMF或DMSO帮助其溶解,这时推荐将多肽溶解于高浓度,然后用水或缓冲液将其稀释到正常的工作浓度。因为盐会导致疏水性多肽的聚合,所以必须在多肽完全溶解后加入缓冲液进一步稀释。当您遇到这种情况时,请您注意以下几点说明:

  a. DMF或DMSO的使用有助于多肽的溶解,这是通过破坏多肽的二级结构而助溶。

  b. 这种试剂的使用可能会对其生物活性及后续的研究工作造成干扰,请您在溶解考虑到这个问题。

    4. 如果多肽溶解不好该怎么办?

    对于使用多肽的研究人员来说,多肽的溶解经常是一个主要的难题。每个氨基酸都有不同的物理特性,所以不同的多肽有着不同的溶解性。通常方法,多肽首次须溶解于蒸馏水,更适合消毒水。如果溶解还是有问题,请尝试如下步骤:声波降解有助于溶解多肽。少量醋酸稀释溶液(10%浓度)有助于一般多肽的溶解,氨水溶液有助于酸性多肽的溶解。我们还推荐将多肽溶解于高浓度,然后用水或缓冲液将其稀释到正常的工作浓度,因为盐会导致聚合。(所以必须在多肽完全溶解后加入缓冲液。)

    5. 是否需要在特殊PH值中溶解多肽?

    报告将会指示是否有特殊PH值的要求。 如果有特殊PH值要求,C.O.A报告中会注明。


其他说明

1) 有些溶解性上写“ACN”,是什么意思?

“ACN”是乙腈,是用来帮助溶解某些肽的。

多肽溶液可能遇到细菌降解。为避免该现象的发生, 多肽应溶解在无菌的蒸馏水中, 或者用0.45或0.2μm孔径的滤膜过滤除菌。

包含Cys、Met、Trp的多肽特别容易氧化, 因此应该溶于无氧的水中。无氧水可以通过注入惰性气体(氮、氦、氩)减压除气得到。

2) 若多肽不溶于纯水,超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。

注意: 超声处理会引起溶液发热和多肽降解。


多肽溶解指南

   合适的溶解方法是多肽实验成功的重要因素。不合适的溶解会造成多肽的损失和实验的失败;然而,寻找理想的溶解方法有时相当有挑战性。

您可以通过本指南中的步骤来选择最佳溶解方法,建议在溶解之前进行小试:通常先用蒸馏水或无菌水进行小试,长度小于五个氨基酸的寡肽尤其如此。对于其他的特殊多肽,需要根据多肽的序列优化溶解条件。


溶解小试指南:

1. 将多肽序列中的每个酸性氨基酸包括天冬氨酸Asp(D),谷氨酸Glu(E)和C端的羧基-COOH赋值为-1;每个碱性氨基酸包括精氨酸Arg(R),赖氨酸Lys(K),组氨酸His(H)和N端的氨基-NH2赋值为+1;中性氨基酸为0。以此为基础计算整条多肽的值,得分为正的称为碱性多肽,得分为负的称为酸性多肽,得分为零的称为中性多肽。

2. 如果是碱性多肽,先尝试用水溶解;如果不能溶解,尝试使用10% - 30%的醋酸;如果多肽还是不溶,尝试使用纯醋酸和三氟乙酸TFA(<50 μl)来溶解,然后将多肽溶液稀释到需要的浓度。

3. 如果是酸性多肽,先尝试用水溶解;如果用水不能溶解,尝试使用13%氨水来溶解,并将多肽溶液稀释至需要的浓度。如果多肽序列中包含半胱氨酸Cys(C),不能使用碱性溶液进行溶解。请尝试下面的方法。

4. 中性多肽通常用有机溶剂来溶解。首先,尝试使用乙腈(acetonitrile),或甲醇(methanol)或异丙醇(isopropanol)

进行溶解;对于疏水性非常强的多肽,先用少量的二甲基亚砜(DMSO)溶解,并用水稀释到需要的浓度;如果多肽序列中含有半胱氨酸Cys(C),使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮 (NMP)进行溶解。对于容易聚集的多肽,先加6M的胍盐酸(guanidine•HCl)或8M的尿素(Urea)来溶解,然后稀释到需要的浓度。


说明:

1. 为了方便储存及后续使用,建议将多肽溶解至浓度为1-2 mg/ml左右。

2. 普通多肽冻干粉可在-20度保存一年以上,对于已溶解的多肽,建议分装后储存于-20℃;如多肽序列中含有甲硫氨酸Met(M),半胱氨酸Cys(C)或酪氨酸Tyr(Y),建议保存于无氧环境防止氧化 。


冻干多肽的溶解

1. 多肽溶解中的主要问题是二级结构的形成。

虽然疏水肽链二级结构的形成更明显,但除了最短的肽链外,该现象发生在几乎所有肽链,与极性无关。因此,溶解多肽的第一个原则是用无菌的蒸馏水或去离子水(如果条件允许则用无氧水)。

2. 若多肽中包含多个碱性氨基酸,使用(1-10%)的乙酸水溶液;对于疏水性非常强的多肽,则使用50%乙酸。

3. 若多肽中含有大量酸性氨基酸,可用氨溶液(1-10%)或乙酸乙基吗啡或重碳酸盐等挥发性的碱性缓冲液溶解。pH值在层析前必须调整。

4. 异丙醇和乙腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱,有机溶剂的量则必须很少,否则将严重影响停留时间。

5. 若多肽因为含有Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala等芳烃侧链而高度疏水,或为中性肽时, DMF或DMSO等膜变性剂的使用,有助于多肽的溶解。

  a. 高浓度膜变性剂通过破坏多肽的二级结构而助溶。

  b. 膜变性剂适于多肽分析液的制备, 但可能会对其生物活性的研究工作造成干扰。

  c. DMF是最佳变性剂(最高浓度可达30%), 滴加至多肽溶解。

  d. 反相层析时, DMF将与洗脱液前峰一起流出, 依注入量的多少, 峰值可能很高。大多数肽能在大量DMF 流出后几分钟内流出, 若肽链很小, 洗脱太早, 多肽的量将降低。

      对于一些难溶解于双蒸水或缓冲液的肽常用稀乙酸(30%-50%)或稀氨水(30%左右)分别对于碱性(含Arg , Lys , His)或酸性(含Asp, Glu)多肽的溶解。这些方法不溶的多肽, 需要用少量DMF、DMSO溶解,然后加入适量缓冲液,这些溶剂可能对某些实验有副作用,所以在实验时要加注意。

注:肽链中含有残基Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Gln, Asn和Val将会增加多肽的溶解难度。



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